После окончания гимназии и Киевского художественного училища учился живописи в Мюнхене. Некоторое время увлекался толстовством. В 1898 году стал студентом медицинского факультета Киевского университета.
До 1917 года он служил врачом в ряде земских больниц средней России, затем был главным врачом Ташкентской городской больницы и профессором Среднеазиатского государственного университета.
В начале двадцатых годов под именем Луки постригся в монахи, был рукоположен в сан епископа. Многократно подвергался арестам и административным ссылкам.
Издал более 50 научных трудов по хирургии и анатомии, а также более десяти томов проповедей. Наиболее известна его книга «Очерки гнойной хирургии», неоднократно переизданная.
После 1955 года Войно-Ясенецкий прекратил хирургическую практику по причине потери зрения.
Его судьба, представляющая собою соединение служения Богу с успешной научной деятельностью, уникальна. В ряде источников приводится интересный диалог:
«На правительственном приёме Сталин спросил епископа Луку:
– Ну, что, хирург, ты много операций сделал, а видел ли ты когда-нибудь человеческую душу?
– Мне много раз приходилось делать операции на голове и вскрывать черепную коробку, но я никогда не видел ума. А мы знаем, что ум существует, – ответил епископ Лука».
Умер Войно-Ясенецкий в сане архиепископа Крымского и Симферопольского 11 июня 1961 года в Симферополе. Канонизирован Русской Православной Церковью в чине новомучеников и исповедников Российских для общецерковного почитания в 2000 году.